【储存条件】 -20˚C
【产品简介】
本产品采用拓扑异构酶 I（Topoisomerase I）的连接原理，不同于使用 T4 DNA 连接酶的传统克隆方法，可在数分钟甚至数秒内高效连接 DNA 片段，可兼容 TA 克隆与平末端克隆。有效连接片段长度可达 10 kb。此外，本产品无自连、零背景，无需蓝白斑筛选，阳性克隆比例高，极少出现空载体，是简单、快速、零背景免筛选的 TOPO 通用型克隆试剂盒。载体上具有氨苄青霉素（Amp）和卡那霉素（Kan）双抗性，有助于减少卫星菌落，便于后续挑取阳性克隆。试剂盒中提供 800 bp 的DNA 片段（Control Insert）作为连接反应的阳性对照，同时提供 M13 F/R Primer Mix 通用型引物用于菌落 PCR 鉴定。
【产品特点】
1. 兼容范围：适用于连接平末端和带3’-A的PCR产物。
2. 快速反应：连接反应仅需5 min。
3. 阳性率高：载体具有氨苄青霉素和卡那霉素双抗性。
4. 简单高效：无自连、零背景，无需蓝白斑筛选。
【产品组份】
20T
pTOPO-TA/Blunt Vector（40 ng/μl） 20 μl
10×Enhancer 20 μl
Control Insert（800 bp 20 ng/µl） 5 μl
M13 F/R Primer Mix（10 μM） 200 μl
【操作步骤】
1. 连接反应的准备：PCR反应需使用非磷酸化引物。扩增产物可为平末端或携带3’-末端A碱基。
注意1：PCR产物，特别是以质粒为模板的PCR产物，推荐进行胶回收纯化后使用，因为模板质粒也可能长出菌落（非目的载体）。
注意2：酶切产物或其它带磷酸化末端的片段，需要进行去磷酸化处理后再进行连接反应。
2. 连接反应：
1） 室温下，按下表配制反应体系。注意：此步骤在室温进行，不能在冰上进行。
组分 样品 阳性对照
纯化后的PCR产物 0.5-8 μl —
Control Insert（800 bp 20 ng/µl） — 1 μl
pTOPO TA/Blunt Vector（40ng/μl） 1 μl 1 μl
10×Enhancer 1 μl 1 μl
Sterile Water 补足至10 μl* 补足至10 μl*
用移液器轻轻吹打或轻弹管底混匀，低速瞬时离心至所有液体在离心管底。
*如果使用5 μl体系连接，各成分按照比例减半使用。为提高加样准确性，尽量使用正常体系操作。
不同大小插入片段的推荐用量：
插入片段大小 最佳用量
100-1000 bp 10-40 ng
1000-2000 bp 40-80 ng
2000-5000 bp 80-150 ng
2） 20-37℃连接5 min。本载体推荐20-37℃放置5 min完成连接，但多数情况下连接1-2 min已经可以得到足够多的转化子。
3） 连接产物可直接转化感受态细胞。如尚未准备好感受态细胞，可以将连接产物短时间置于冰上备用。
3. 转化：以常规化学转化为例，具体方法请参考所使用感受态细胞的说明书；电转化需首先对连接反应液进行脱盐处理。
1） 将感受态细胞置于冰上融解。取适量连接反应液加入至感受态细胞中（连接反应液体积≤10%感受态细胞体积），轻柔混匀，冰浴10-30 min。 42℃加热45-60 s后，冰浴2 min，该过程不要摇动离心管。
2） 加入800 μl SOC或LB培养基，37℃振荡培养40-60 min。将菌液均匀涂布到含100 μg/ml氨苄青霉素（Amp）或者50 μg/ml卡那霉素（Kan）的LB琼脂平板，37℃培养12-16 h。
4. 转化子筛选鉴定：
1） 菌落/菌液PCR：可选用M13 F/R Primer Mix或基因特异性引物进行菌落/菌液PCR扩增。推荐使用AFT mix（AFT2001）。应尽可能设立阳性对照和阴性对照反应。
2） 酶切鉴定：挑取白色正常菌落，摇菌抽提质粒。插入片段较大的情况下，可直接电泳观察质粒大小即可鉴定出是否含有插入片段；也可用EcoR I/EcoR V单酶切释放插入片段或用其它合适的内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，确定是否含有目的片段。
3） DNA测序：选用M13 Forward和M13 Reverse通用型引物进行测序鉴定。
