“温馨提示”
一、片段/载体摩尔比（也就是分子个数比）的计算方法：摩尔比与片段长度成反比，与浓度和加入体积成正比。
片段/载体摩尔比=（载体大小/片段大小）X （片段浓度/载体浓度） X （片段加入体积/载体加入体积）。
二、引物合成公司生产的引物默认没有5'-磷酸基团，因而无法直接相连。做多片段无缝克隆时，如果连接效率低，合成带有5'-磷酸的引物，或者对PCR产物用磷酸激酶处理，使之可以在连接酶作用下形成完整载体，以便提高成功率。
【储存条件】长期保存，请置于-20˚C，有效期6个月。使用后请及时放入-20˚C保存以保证酶的活性。
【产品简介】
本产品不依赖于T4 DNA连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接用重叠片段重组的方法，采用特殊的酶组合可以将任意方法线性化后的载体和与其两端具有15-25bp重叠区域的PCR片段定向重组，可以快速实现1-5个片段的高效无缝克隆。本产品和其他品牌设计思路不同，采用5x高浓缩形式，使得反应体系中能加入更多目的片段和载体，从而提高连接效率，特别适合一些高难度的拼接反应。
【产品特点】
1. 30分钟可以将一个或者多个长、短PCR扩增片段（平末端或者A粘性末端）插入载体。
2. 不受载体和插入片段酶切位点的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位点进行克隆。
3. 无缝克隆，插入点不会引入不需要的碱基序列，高效、准确，阳性率＞95%。
【操作步骤】
注意：AFT SuperFast Seamless Assembly and Cloning mix含有连接增强剂很粘稠，从冰箱拿出来温度低时更粘稠，可以放在手心化冻几分钟提高温度便可降低粘稠度（不影响质量），轻弹混匀，瞬间离心收集到管底。
1. 按照下表建立反应体系（可使用PCR管在室温操作）
Linear Vector (10-80ng)* | X μl |
Linear Insert** | Y μl |
AFT SuperFast Seamless Assembly and Cloning mix | 2μl |
ddH2O补足至（尽量多加片段和载体，少加水！） | 10 µl |
注意：必须通过DNA电泳对比条带亮度进行定量，仅靠OD值是不够的（因为某些时候OD值可能虚高）。
* 载体一般用20-50 ng。
** 插入片段与载体的摩尔比在2:1-3:1之间最佳；如果插入片段小于200bp，插入片段与载体的摩尔比用5:1。
多片段同源重组反应最适DNA使用量为：载体与各个插入片段摩尔比为1 : 1。（具体算法请看前面温馨提示）
2. 轻轻混匀，在37˚C（如果同源臂GC含量高，可以提高到50-55 ˚C）反应15-30分钟（可在PCR仪器上进行），反应结束后，将PCR管置冰上，直接转化或者保存于-20˚C。较短片段例如100bp-1kb只需要15分钟便能获得足够转化子，较长片段的连接，可以延长反应时间到60分钟。
3. 取5μl反应产物按照感受态细胞说明书进行转化。重组产物加入的量不要超过感受态体积的1/10，比如5ul反应物加入至少50ul感受态细胞中，如果转化子较少，可以将所有的产物转化并将所有的转化液涂板。
4. 可根据具体情况，选择菌落PCR鉴定（货号AFT2001），提取质粒（货号AFT2015）进行限制性内切酶鉴定或测序鉴定。
