【储存条件】 -20˚C
【产品概述】
随机突变是阐述蛋白质结构和功能之间的关系、改进蛋白质性能的重要工具。AFT SuperFast随机突变试剂盒基于易错PCR (error-prone PCR) 技术，利用Taq DNA polymerase不具有3′→5′校对功能的特性，在特定的反应缓冲体系中，向扩增的目的基因中引入随机突变密码子。带有随机突变的扩增产物通过双酶切，连接到表达载体中构建文库，然后转化入表达宿主中，进行蛋白活性筛选。如果经一次突变反应不能获得满意的结果，可采用连续易错PCR (sequential error-prone PCR)策略，即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的突变累积而产生更有意义的突变。
本试剂盒包含有优化的2 x AFTMut Random System、AFTMut Enhancer和ddH2O三种组分，使用时只需加入适量的DNA模板和合成的两条扩增引物，并用水补足体积，即可进行扩增反应，操作简便快速，大大减少了多次加样可能造成的出错和污染机会。2 x AFTMut Random System含有优化浓度的Taq DNA polymerase、dNTPs、反应缓冲液和稳定剂，可最大限度地克服常规易错PCR 技术中，由于Taq DNA polymerase本身的偏爱性造成的以GC突变为主的缺点，获得相对均衡的突变谱。碱基突变率可通过适量添加AFTMut Enhancer、调整模板DNA量和改变PCR扩增循环数进行控制。
下表列出以10 ng质粒DNA为模板，PCR扩增一条1 kb DNA片段(20个循环)后测序检测得到的突变率结果。需要注意的是，由于不同DNA模板的碱基组成不同、长度不一，以及不同引物的扩增效率存在差异，所以即使在相同的PCR反应条件下，两组PCR产物所得到的突变率也可能不同。因此我们建议根据实验的具体要求，首先进行多个小体系(20 μl)扩增预实验，分别加入不同体积的AFTMut Enhancer(如0 μl、1μl、5 μl、10 μl等)，摸索出符合目标突变率的反应条件后，再放大扩增体系。其他影响突变率的因素见
“注意事项”部分。
反应条件 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
AFTMut Enhancer (μl) | 0 | 1 | 2.5 | 5 | 10 | 20 |
突变碱基的个数/1 kb | 0~1 | 0~3 | 0~4 | 1~6 | 3~10 | 5~18 |
平均突变碱基数/1 kb | 0.3 | 1.6 | 2.3 | 4.1 | 6.5 | 10.2 |
本试剂盒适用于扩增低于4 kb、GC含量在70%以下的目标DNA片段。
【产品组分】
2 x AFTMut Random System | 0.5 ml |
AFTMut Enhancer | 0.1 ml |
ddH2O | 1 ml |
【使用方法】
1．引物设计原则：
(1) 正、反向扩增引物各一条，长度约20~45个碱基，3’端分别与目标突变DNA片段的上下游结合；
(2) 尽量将引物的GC含量控制在40~60%；
(3) 引物如带有克隆酶切位点，必须添加足够的保护碱基以确保酶切效率；实验证明，引物结合在目标DNA片段的酶切位点外侧可提高酶切效率，增加转化的克隆数量。
2．随机突变反应：
(1) PCR反应体系：
向PCR薄壁管中依次加入下列试剂
质粒DNA模板(1~10 ng/μl) * 1 μl
2 x AFTMut Random System 25 μl
正向扩增引物 (10 μM) 1 μl
反向扩增引物 (10 μM) 1 μl
AFTMut Enhancer 0~20 μl
ddH2O 补足体积至 50 μl
(2) 混匀后短暂离心，放入PCR仪。
(3) PCR循环参数的设置：
95℃ 2 min
94℃ 30 sec
50~65℃ 1 min x 16~25 cycles*
72℃ 1 min/1 kb
72℃ 7 min
* 突变率可通过改变起始模板浓度和扩增循环数进行控制。起始模板浓度越高，突变率越低；扩增循环数越高，突变率越高。
3．取1~5 μl PCR产物电泳检测条带浓度和特异性。
4．剩余的PCR产物电泳，切胶回收目标DNA片段。
5．酶切、连接、转化到表达宿主菌株中进行筛选。
【注意事项】
1． 由于不同DNA模板的碱基组成不同、长度不一，以及不同引物的扩增效率存在差异，所以即使在相同的PCR反应条件下，两组PCR产物所得到的突变率也可能不同。因此我们建议根据具体实验要求，首先进行多个小体系（20 μl）扩增预实验，分别加入不同体积的AFTMut Enhancer（如0 μl、1 μl、5 μl、10 μl等），通过测序或活性检测等方法，摸索出符合目标突变率的反应条件后，再放大扩增体系。
2． 起始DNA模板的浓度对突变率有很大影响，通常可通过提高或降低DNA模板的浓度来调整突变率。鉴于不同型号的分光光度计检测的DNA浓度存在偏差，DNA模板最好在酶切线性化后，采用凝胶电泳方法，与已知浓度的线性化双链DNA或商品化的DNA marker进行对比，确定其浓度。
3． 突变反应产物必须进行切胶回收处理，去除DNA模板、PCR产物上结合的Taq酶以及其他杂质。常规的乙醇沉淀、硅胶膜（珠）或玻璃奶吸附等方法，均无法去除结合的Taq酶，后者可能遮蔽酶切位点，影响克隆效率。
4． 建立随机突变文库通常需要10~200 ng/μl （相当于500 ng ~10 μg/50 μl体系）的PCR产物。如遇产量不足，可通过下列方法提高产量：
(1) 突变率符合需求时，可放大PCR体系，或切胶回收PCR产物后，采用常规PCR反应条件进行扩增；
(2) 突变率低于需求时，提高PCR扩增循环数，或切胶回收PCR产物后，进行第二轮随机突变反应；
(3) 重新设计扩增引物;
(4) 降低退火温度；
(5) 确保模板质量，采用凝胶电泳方法精确定量。
5． 对于带有克隆酶切位点的DNA模板，必须在PCR反应结束后，使用DpnI完全消化清除甲基化的模板，再切胶回收目标DNA片段。对于非甲基化的质粒（例如从大肠杆菌JM110或SCS110菌株中提取的质粒），可通过转化dam＋ 的大肠杆菌菌株（如DH5α、TOP10、JM109、XL1-Blue等），再抽提获得甲基化的质粒作为PCR反应模板。
6． 经过双酶切的克隆载体在插入突变DNA片段前，应首先通过自身连接检测，确保极低的自连背景。必要时可采用去磷酸化、切胶回收等方法把自连率降至最低，以免影响后续连接反应。
