【储存条件】 常温运输，室温（15~30˚C）保存。
【产品简介】
本试剂盒适用于无内毒素质粒DNA的小提中量制备。菌体经碱裂解、高盐、低pH处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心柱硅胶膜吸附。再经内毒素清除液清洗，可将绝大多数菌体内毒素清除干净，然后通过清洗液的清洗可去除蛋白及其他杂质，最后在低盐、高pH条件下洗脱得到高纯度无内毒素的质粒DNA。使用本试剂盒可从5 ~ 10 ml过夜培养的菌液中纯化得到高达70 ug的无内毒素质粒DNA，所得质粒除可用于常规分子生物学实验外，还适合细胞株的转染实验。
【产品特点】
1. 快捷、高效：操作简便，得率高，节约时间；
2. 纯度高：沉淀致密，去杂干净；
3. 内毒素去除简单：柱上去除内毒素，方便快速，清除干净。
【产品组份】
试剂盒成分 | 50T |
Buffer BL | 25 ml |
Solution I | 30 ml |
Solution II | 30 ml |
Solution N3 | 30 ml |
ToxinOut Buffer | 30 ml |
Buffer WB2（concentrate） | 15 ml |
Buffer EB | 15 ml |
RNase A (10 mg/ml) | 600 ul |
MiniSpin Column With Collection Tubes | 50套 |
注意：使用前将全部RNase A溶液加到Solution I中混合均匀，2 ~ 8℃保存;按要求在Buffer WB2中加入无水乙醇。
【实验准备】
1. 细菌培养时间一般为12 ~ 16 小时，如接种量大则应减少培养时间，过度培养会降低质粒质量甚至导致质粒DNA突变；
2. 每次使用时都要注意Solution II和N3是否形成沉淀，如有沉淀37℃溶解后再用；
3. 注意溶液I，II和N3的用量比例，若细菌量增大，需按比例放大这些溶液的使用量；
4. 质粒的产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。
【操作步骤】
柱平衡：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入400 μl的平衡液BL，12,000 rpm (-13,400×g ) 离心1 min，弃收集管中滤液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
（请大家别嫌这步麻烦，它是为了盒子放置时间长不用，处理一下效果如新，减少浪费。如果新开封马上用，可以不做柱平衡）
1. 取5 ~ 10 ml过夜培养的菌液，室温12,000 rpm离心1 min，尽量将上清去除干净。
注意：根据菌液的浓度决定取液量，浓度高时取1.5 ml菌液离心即可，浓度低时可多收集一次。
2. 加入500 ul Solution I，旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀。
注意：菌体沉淀一定要悬浮均匀，如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低。
3. 加入500 ul Solution II，温和颠倒混匀使菌体完全裂解，直到溶液变成清亮、粘稠。
注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组DNA片段的污染，所用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加Solution II的用量，在后续的操作中Solution N3的用量也要相应增加。
4. 加入500 ul Solution N3，立即温和颠倒混匀，可见红黄相间的沉淀物产生，继续混匀直到完全变为黄色，室温静置2 min，然后12,000 rpm离心5 min。
注意：Solution N3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如果上清中还有紫色漂浮物，说明复性不充分，继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色.
5.小心将上清液转移到一个新的离心管中，加入0.3倍的异丙醇，混匀。然后将上述液体转入离心吸附柱中，静置2 min，让质粒DNA与吸附柱中的硅胶膜充分结合。12,000 rpm离心0.5min，弃收集管中滤液。（注意：吸附柱一次只能转移750ul液体，剩余液体分次转入）
6. 向吸附柱中加入500 ul ToxinOut Buffer，室温静置5min，12,000 rpm离心1 min，弃收集管中滤液。
7. 加入600 ul Buffer WB2，室温12,000 rpm离心0.5 min，弃收集管中滤液。
注意：Buffer WB 2为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发。
8. 加入500 ul Buffer WB2，室温12,000 rpm离心2 min，甩干残留液体。
注意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用。
9. 将离心吸附柱置于一个新的1.5 ml塑料离心管（自备）中，加入100 ~ 300 ul的洗脱液Buffer EB，室温放置2 min。12,000 rpm离心1 min，离心管底溶液即质粒DNA。
注意：为增加洗脱效率，可将洗脱液在60℃预热。如需使用去离子水洗脱，可用NaOH调整其pH值在7.0 - 8.5之间，为了增加质粒回收率，可将得到的溶液重新加入到离心管中，室温放置2 min，再次离心收集。
【低拷贝或大质粒（>10 kb）提取】
如果所提质粒为低拷贝质粒，或大于10 kb的大质粒，或提取农杆菌质粒，或提取革兰氏阳性菌质粒，应加大菌体使用量，使用5 ~ 10 ml过夜培养物，同时按照比例增加Solution I、II、N3的用量，洗脱液Buffer EB应在60℃水浴预热，在吸附和洗脱时可以适当延长时间，以增加提取效率。其它步骤相同。
