【储存条件】
室温储存12个月不影响使用效果。本试剂盒所有溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，可在37°C水浴加热几分钟，恢复澄清后再使用。
【产品简介】
在本公司独家研发的基因组DNA清除柱技术可以有效清除gDNA残留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，植物RNA助提剂RX帮助结合多糖多酚并通过离心去除，然后裂解混合物用乙醇调节RNA结合吸附到基因组DNA清除柱，然后RNA被选择性洗脱滤过， 吸附在基因组DNA清除柱上的残留DNA无法洗脱连同柱子一起丢弃从而 清除掉DNA。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase-Free H2O将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。本产品也可以用来提取丝状真菌和复杂真菌的RNA，操作方法同植物样本。
【产品特色】
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用Whatman特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
2. 不需要苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀，快速方便，一般可在25-30分钟内完成。
3. 独有的植物RNA助提剂RX可以有效结合多糖多酚，提高清除效果，应用性极广，可以轻松提取棉花、松针等多糖多酚的样品。
4. 独家研发成功基因组DNA清除柱技术可以有效清除gDNA残留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
5. 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达2.0-2.2，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。
【产品组份】
50T 注意事项
裂解液RLT 50ml 室温密闭干燥保存
裂解液CLB 8ml 室温密闭干燥保存
裂解液RLT Plus 25ml 室温密闭干燥保存
去蛋白液RW1 40ml 室温密闭干燥保存
漂洗液RW 10ml 初次使用前请按瓶标说明加入指定量的无水乙醇
RNA助提剂RX 5 ml 室温密闭干燥保存
RNase-Free H2O 10ml 室温密闭干燥保存
基因组DNA清除套管(GA) 50套 室温密闭干燥保存
RNase-Free吸附套管(RA) 50套 室温密闭干燥保存
【注意事项】
1. 所有的离心步骤均在室温完成（4°C离心也可以），使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2. 需要自备乙醇（尽量新开封或者RNA专用），研钵。
3. 裂解液RLT、RLTplus 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. 样品处理量绝对不要超过基因组清除柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
5. 预防RNase 污染，应注意以下几方面：
1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。
2) 使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3) RNA 在裂解液RLT 中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150°C烘烤4 小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4) 配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，37°C放置过夜，高压灭菌。）
6. 关于DNA 的微量残留：
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，本产品采取了独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大, 如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：
1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3) 将RNA提取物用RNase-Free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。
4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
7. 仔细阅读补充说明2，如果裂解液CLB效果好，可以联系我们单独订购裂解液CLB。以后可直接订购AFT2028 多糖多酚复杂植物RNA快速提取试剂盒。
【操作步骤】
<实验前请先阅读注意事项，第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量的无水乙醇!>
1. 直接研磨法（提取简单植物样品推荐此法，但是简单样品也可以用液氮研磨法）:
a. 新鲜植物组织称重后取100-200mg迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100-200mg放入研钵）， 加入10体积（1ml）RLT和1体积（100μl） 植物助提剂RX 室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。
<注：植物助提剂RX是提取多糖多酚次级代谢产物色素含量丰富的困难样品不可缺少成分>。
b. 将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13,000rpm离心5-10分钟，去除不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的植物助提剂RX。
c. 取480μl裂解物上清（在不超过RNA吸附柱能力的情况下可以取更多或者全部上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
d. 立刻接操作步骤的步骤3。
2. 液氮研磨法（提取复杂，易降解样品时推荐此法）:
a. 取500μl裂解液RLT，转入1.5ml离心管中，加入50μl 植物助提剂RX混匀备用。
b. 液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50-100mg细粉转入上述装有RLT和RX的离心管，立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。
c. 剧烈涡旋震荡 (或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
d. 将裂解物13,000 rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的植物助提剂RX。
e. 取裂解物上清（在不超过RNA吸附柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
f. 立刻接操作步骤的步骤3。
<注意：以上液氮研磨法用户可以根据需要加倍处理，可以提高产量。也就是使用1ml的裂解液RLT和100μl 植物助提剂RX和100-200mg的样品>。
3. 将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱(GA)中，（清除柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。
<确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间>。
4. 将基因组DNA清除柱子放在一个干净2ml离心管内（不用RNAse free 或者DEPC处理，一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管），在基因组清除柱内加500μl裂解液RLT Plus，13,000 rpm离心30秒， 收集滤液（RNA在滤液中），用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为450-500μl左右，滤过时候损失体积应该减去），加入0.5倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
5. 立刻将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。
<确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间>。
6. 加700μl 去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
7. 加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，重复一遍。
8. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
9. 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase-Free H2O（事先在70°C水浴中加热可提高产量）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。
10. 如果预期RNA产量>30μg，加30-50μl RNase-Free H2O重复步骤9，合并两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
<洗脱两遍的RNA洗脱液RNA浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据需要选择>。
