【储存条件】 常温保存，组分若有沉淀，在37˚C水浴加热恢复澄清后使用。
【产品简介】
AFT多糖多酚植物RNA提取试剂盒，不需苯酚、氯仿，含有独家基因组DNA清除柱技术可以有效清除gDNA残留，得到的RNA可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。本产品具有强大的提取能力，很多其他品牌提取失败的样本，我们能轻松提取出来。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶， 离心沉淀去除多糖多酚和次级代谢产物，然后裂解混合物用乙醇调节RNA结合吸附到基因组DNA清除柱，然后RNA被选择性洗脱滤过， 吸附在基因组DNA清除柱上的残留DNA无法洗脱连同柱子一起丢弃从而清除掉DNA。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free H2O将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
【产品特色】
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
2. 不需要苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀，快速方便，一般可在25-30分钟内完成。
3. 应用性极广，已经成功提取过300多种复杂植物样品。
4. 基因组DNA清除柱技术有效清除gDNA残留，得到的RNA可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
5. 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达2.0-2.2。
【产品组份】
50T 注意事项
裂解液CLB 50ml
裂解液RLT Plus 25ml
去蛋白液RW1 40ml
漂洗液RW 10ml 初次使用前请按瓶标说明加入指定量的无水乙醇
RNase-Free H2O 10ml
基因组DNA清除套管 50套
RNase-Free吸附套管(RA) 50套
【注意事项】
1. 所有的离心步骤均在室温完成（4˚C离心也可以），使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机。
2. 需要自备β-巯基乙醇、乙醇（尽量新开封或者RNA专用），研钵。
3. 裂解液CLB、RLTplus 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. 样品处理量绝对不要超过基因组清除柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
5. 预防RNase 污染，应注意以下几方面：
1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。
2) 使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3) RNA 在裂解液RLT 中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150˚C烘烤4 小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4) 配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，37˚C放置过夜，高压灭菌。）
6. 关于DNA 的微量残留：
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，本产品采取了独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大, 如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：
1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
【操作步骤】
<实验前请先阅读注意事项，第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量的无水乙醇!>
实验前准备：取1ml裂解液 CLB至离心管内 (如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解），在裂解液CLB中加入5% β-巯基乙醇（1ml CLB加50μl β-巯基乙醇）。颠倒混匀后65°C水浴中预热。多个样品按照比例放大准备。
1. 直接研磨法（实验室无液氮情况下或者柔软易研磨植物样品推荐此法）:
a. 新鲜植物组织或者冰冻保存样品称重后取100-200mg（水分少的样品如叶片种子等可加100-150mg，水分多的样品如草莓西瓜果实可多加一些）迅速剪成小块放入研钵，加入 1ml CLB（已加有β-巯基乙醇）室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液CLB立刻充分接触以抑制RNA酶活性。
<β-巯基乙醇是裂解液CLB的关键成分，必要的时候可以提高终浓度到10-20%。如果特别复杂植物，可以尝试在裂解液中加入PVP40至终浓度2%>。
b. 将裂解物转入离心管，立即剧烈振荡15秒，短时放回 65°C水浴中（5-10 min），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。13,000rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。
c. 取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
<若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可>。
d. 立刻接操作步骤的步骤3。
2. 液氮研磨法（适用广泛，提取复杂难破碎，易降解样品时推荐此法）:
a. 液氮中研磨新鲜或-70°C冷冻的材料至细粉。
b. 转移100-200mg细粉（水分少的样品如叶片种子等可加100-150mg，水分多的样品如草莓西瓜果实可多加一些）加至预热的裂解液CLB（已加有β-巯基乙醇）离心管中。立即剧烈涡旋30-60秒或者用吸头吹打混匀裂解直得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
c. 短时放回 65°C水浴中（5-10 min），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。
d. 将裂解物13,000 rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。
e. 取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
<若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可>。
f. 立刻接操作步骤的步骤3。
3. 将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱中，13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。
<确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间>。
4. 将基因组DNA清除柱子放在一个干净2ml离心管内（不用RNAse free 或者DEPC处理，一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管），在基因组清除柱内加500μl裂解液RLT Plus，13,000 rpm离心30秒， 收集滤液（RNA在滤液中），用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为450-500μl左右，滤过时候损失体积应该减去），加入0.5倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
5. 立刻将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。
<确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间>。
6. 加700μl 去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
7. 加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，重复一遍。
8. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
9. 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase-Free H2O（事先在 70˚C水浴中加热可提高产量）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。
10. 如果预期RNA产量>30μg，加30-50μl RNase-Free H2O重复步骤9，合并两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
<洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择>。
