【储存条件】 -20˚C
【产品简介】
本产品是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒中使用的AFT M-MuLV RTase逆转录酶是M-MLV由来的新型高效逆转录酶，新颖突变位点大幅提升酶的转录活性，cDNA第一链合成的效率和产量更高，可利用pg级的总RNA或mRNA合成cDNA第一链。点突变消除RNase H活性，酶的延伸性能提高，有效改善逆转录酶与RNA模板的亲和力，可获得长至12 kb的cDNA。精心优化的RT Buffer使逆转录酶应用范围更广，对后续的PCR以及定量PCR实验兼容性高。该试剂盒配备所有逆转录试剂，使用简单方便。适用于第一链cDNA的合成和后续的RT-PCR、RT-qPCR，以及全长cDNA文库的构建等。
【产品特点】
1．高效的逆转录效率：新颖突变位点大幅提升酶活性能，获得更高产量的cDNA。
2．良好的延伸能力：点突变消除RNase H活性，改善逆转录酶与RNA模板的亲和力，可获得长至12 kb的cDNA。
3．灵敏度高：可利用pg级的总RNA或mRNA模板合成cDNA第一链。
4．使用方便：逆转录试剂盒中已配备所有逆转录试剂，仅需准备模板即可轻松完成逆转录。
【产品组分】
100T
AFT M-MuLV RTase (200 U/μl) 100 μl
5x AFT M-MuLV RTase Buffer* 500 μl
Primer Mix 240 μl
dNTP Mix, 2.5 mM 500 μl
DTT, 0.1M 240μl
RNase-Free Water 1 ml
【注意事项】
1．在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套。
2．实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37˚C处理12小时，并在120˚C下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃器皿在180˚C下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。
3．本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20˚C，避免反复冻融。
4．若起始RNA的量小于50 ng，建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。
【操作流程】
注意：1 ng-5 μg总RNA可建立20 μl反应体系，如果总RNA量大于5 μg，请按比例扩大反应体系。
1．将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、AFT M-MuLV RTase和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2．根据以下表格配制反应体系，总体积为13 μl 。
Primer Mix 2 μl
dNTP Mix, 2.5mM each 4 μl
RNA 模板 ≤2 μl (1~5 µg 总 RNA 或 0.1~0.5 µg poly(A) mRNA)
RNase-Free Water 补足至 13 μl
3．70˚C孵育10分钟，迅速冰浴2分钟。
4．短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
5．继续向以上反应液中加入以下试剂：
5x RTase Buffer 4 μl
DTT, 0.1M 2 μl
AFT M-MuLV RTase 1 μl
至 20 μl
注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。
2）Primer Mix由Oligo (dT)和Random Primer配制而成。如果需要单独的Oligo 18(dT)，Oligo15(dT)或者Random Primer，可以向AFT单独购买或者定制。
6．进行cDNA第一链合成：
50˚C孵育30-50分钟，85˚C孵育5分钟。
7．反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
8．逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，加入量应小于PCR反应体系的1/10，或置于-20˚C长期保存。
