【储存条件】
-20˚C。使用后请及时放入-20˚C保存以保证酶的活性。
【产品简介】
AFT qPCR RT kit with gDNA remover将去除基因组DNA（gDNA）酶和buffer进行了一管化处理，专为两步法 RT-PCR 第一步实验设计的超高灵敏度 RT-PCR 反应系统，可以从极低量的总 RNA 或 poly(A) mRNA 合成第一链 cDNA，并能够通读 GC 含量高、二级结构复杂的 RNA 模板。通常通过柱纯化的RNA经常混入微量的gDNA，当检测目的基因中存在假基因或者无法横跨内含子设计引物时，混入的gDNA会被当成模板扩增，影响数据的准确性。本试剂盒增加了具有强力降解DNA的gDNA清除剂，通过该组分将混入RNA的gDNA降解，无需纯化即可对RNA进行反转录。另外，本产品将引物配比、反转录酶和RNase抑制剂优化成mix形式，精简了试剂盒组成，非常简便操作，而且对后续Realtime PCR反应体系影响也降到最低。
【产品特点】
1) 去除gDNA：只需2分钟，就可以实现去除基因组DNA污染。
2）方便快捷：mix配制，组分更少，操作更快；逆转录只需15min就可以完成。
3）超强对后续qPCR反应适用性：通过组分和Buffer优化，使带入到后续qPCR反应的逆转录反应液的影响降到最低。
4）高灵敏度：对极少量的RNA模板也可以进行良好的反转录反应。
【产品组分】
AFT2031-01
10x gDNA plus Remover Mix 100 μl
5x AFT RT Super plus Mix* 400 μl
DEPC-ddH2O 1.5 ml
* 5x AFT RT Super plus Mix：由AFT plus M-MuLV Reverse Transcriptase，RNase inhibitors, Oligo dT primer, Random Primer, Buffer, dNTPs等构成的Mix形式。打开盖子前，请先离心，使液体落在离心管底部后再使用。另外，本试剂粘度很高，请小心使用移液器。
【活性定义】
以 poly(rA)为模板，oligo(dT)为引物，在 42˚C条件下，10 分钟内催化 1 nmol 的 dTTP 所需要的酶量定义为一个活性单位(U)。
【注意事项】
1. 实验过程中请全程注意避免 RNase 污染。
2. 除酶以外的各种试剂，使用之前请完全溶解并充分混匀，以防因盐离子浓度不均影响实验结果。
3. RNA 模板的完整性对 cDNA 合成效率起着决定性作用，因此请选择可靠的 RNA 提取/纯化方法。建议使用AFT Total RNA Extraction Reagent (TRIgent) (货号 AFT2024-01或者AFT2025-01) 制备高质量的 RNA 模板，并设置反转录反应阳性对照。
4. AFT M-MuLV RTase 以 RNA 为模板获得全长的第一链 cDNA，其起始位点由所用引物所决定：
1) 随机引物 (Random Primer) 在 RNA 模板上没有特异性结合位点，所有 RNA 都可以做为第一链 cDNA 合成的模板；
2) Oligo dT Primer 只能以 poly(A) mRNA 作为 cDNA 合成的模板；
3) 采用序列特异性引物 (Gene Specific Primer) 以其结合位点为起始位点。
5. AFT M-MuLV RTase 合成的第一链 cDNA 产物可直接加入 PCR 反应混合物中进行扩增。PCR 扩增使用的耐热 DNA 聚合酶和热循环条件需要根据目的片段的大小、GC 含量、引物特性、以及对保真度的要求等进行选择。
6. 第一链 cDNA 合成产物经过处理后可作为第二链合成的模板，合成含各种标记的 cDNA，作为杂交实验的探针。
7. RNA 可置于-70˚C以下长期保存，cDNA 合成产物可置于-20˚C保存。
【操作流程】
1. 根据以下表格在冰上配制反应体系，总体积为10μl。为了保证反应液配制的准确性，先按反应数+2的量配制预混体系，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA：
10x gDNA plus remover mix 1 μl
RNA 模板 0.01~1 µg**
DEPC-ddH2O 补足至 10 μl
** 如果总RNA量大于1 µg，请按比例扩大反应体系.
将反应液轻轻搅拌均匀，短暂离心使管壁上的溶液收集到管底，42˚C温育2 分钟，然后置于冰上冷却。
2. 接着反转录反应，在冰上加入下列成分（可根据需要，扩大反应体系）：
步骤（1）的反应液 10 μl
5x AFT RT Super plus Mix 4 μl
DEPC-ddH2O 6 μl
20 μl
3. 轻轻混匀，短暂离心；37˚C孵育，15min；85˚C加热 5秒钟使酶失活；置于冰上进行后续实验或冷冻保存。
注意：Realtime PCR时，作为模板直接稀释后添加（添加到PCR反应液中的反转录稀释液，尽量不要超过20%，以免导致PCR反应效率低下，无法准确定量）。
