【储存条件】
长期保存，请置于-20˚C，有效期12个月。使用后请及时放入-20˚C保存以保证酶的活性。
【产品简介】
本试剂盒是专为一步法RT-PCR实验研制，逆转录和PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。本试剂盒包括全新高效逆转录酶、快速热启动DNA聚合酶，同时包含适用于逆转录和PCR扩增的反应缓冲液和实验中所必需的其它组分。AFTRT逆转录酶RNase H活性缺失，减少了逆转录反应中RNA的降解。该逆转酶逆转录效率高，可对少量RNA模板进行良好的逆转录反应。PCR反应使用的快速热启动DNA聚合酶具有扩增效率高、特异性强、延伸速度快的优良性能。独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。使用本试剂盒扩增得到的目的产物3′端附有一个″A″碱基，可直接用于T/A克隆。
【产品组分】
AFTRT OneStep Enzyme Mix 50 μl
2×AFTRT OneStep Buffer 1.4 ml
RNase-Free Water 1.5 ml
【注意事项】
1．在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套。
2．实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。
3．本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。
4．本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好坏直接影响到RT-PCR 反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长度，引物位置，PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件来设计。
【操作流程】
1．将RNA模板、引物、OneStep RT-PCR Buffer、AFTRT OneStep RT-PCR Enzyme Mix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2．向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入下表中试剂，至终体积25 μl：
试剂 25 μl反应体系 终浓度
2×AFTRT OneStep Buffer 12.5 μl 1×
Forward Primer，10 μM 1 μl 0.4 μM
Reverse Primer，10 μM 1 μl 0.4 μM
AFTRT OneStep Enzyme Mix 0.5 μl
RNA Template X μl 1 pg-1 μg
RNase-Free Water up to 25 μl
注意：引物浓度请以终浓度0.1-1.0 μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引
物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
3. 涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4．将热循环仪预热到45℃，将PCR管置于热循环仪中，进行RT-PCR反应。
反应条件：
步骤 温度 时间
反转录 45℃ 30 min
PCR预变性 95℃ 2 min
以下30-40个循环
变性 94℃ 30 s
退火 55-65℃ 30 s
延伸 72℃ 30 s
终延伸 72℃ 5 min
注意：1）一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为20-30秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2）延伸时间根据扩增的片段大小设定，本产品中包含的DNA Polymerase扩增效率为1 kb/30s。
3）可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。
5．反应结束后取5 μl反应产物，加入适量上样缓冲液后进行电泳检测结果。
