AFT Cell Counting Kit (CCK) CCK-8细胞增殖与活性检测试剂盒

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【储存条件】

4˚C避光保存（保质期1年），或-20˚C避光保存（保质期2年）。避免反复冻融

【产品概述】

CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一种基于WST（水溶性四唑盐，一种类似于MTT的化合物）的细胞增殖与活性检测试剂盒，是用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。在电子耦合试剂存在的情况下，WST被线粒体内的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的甲臜染料（formazan），甲臜染料直接溶解在培养基中。细胞增殖越多越快，则培养基的颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

【CCK-8法与MTT法的比较】

【用途】

用于生物活性因子的活性检测、抗肿瘤药物的筛选、细胞增值的测定、细胞毒性检测以及药敏等与细胞活性和增殖相关的实验。本试剂盒使用方便，试剂盒包含一管已经配制好的含有水溶性四唑的CCK-8溶液，即开即用，无需其他准备步骤。检测过程也无需采用额外的步骤去溶解甲臜，可直接使用96孔板或者384孔板在酶标仪上检测，适合大规模，高通量的样品检测。

【使用方法】

一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时）

1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2. 按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。

3. 接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（适用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，尤其加入CCK-8后的培养时间要一致）。

二、细胞活性检测

1. 在96孔板中接种细胞悬液（100μl/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（37℃，5% CO₂）。

2. 向每孔加入10μl的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，以免影响OD的读数）。

3. 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4. 用酶标仪测定450nm处的吸光度。

5. 如果暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μl的0.1M的HCl溶液或1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光室温保存，24小时内吸光度不会发生变化。

三、细胞增殖-毒性检测（以96孔板为例）    

1. 在96孔板中配置100μl的细胞悬液（通常细胞增殖实验每孔加入100μl约2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100μl约5000个细胞。具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素决定）。按照实验需要，进行预培养。

2. 向培养板加入1-10μl不同浓度的待测药物刺激。

3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（后面有具体细胞的建议时间，例如：6、12、24或48小时）。

4. 每孔加入10μl的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，以免影响OD读数）。如果起始的培养体积为200μl，则需加入20μl CCK-8溶液，其他情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

5. 在细胞培养箱内继续孵育1-4小时（对于大多数情况孵育1小时就可以）。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2 和4小时候分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

6. 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。

7. 如果暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCl溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光室温保存，24小时内吸光度不会发生变化。
注意：如果待测物质有氧化或还原特性，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（先用培养基洗涤细胞两次），去掉药物影响。如果药物影响比较小，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

【活力计算】

细胞活力*（%）=[A（加药）-A（空白）]/[A（0 加药）-A（空白）] ×100

A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度

A（空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度

A（0 加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力