【储存条件】 4˚C避光保存
【产品概述】
Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒是一种采用Annexin V-FITC 与 PI 双染法进行细胞早期凋亡分析的检测试剂盒。细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。Annexin V 具有易于结合到磷脂类如PS 的特性，对 PS 有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就被破坏。另外一种活细胞非透过性荧光染料碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）不能通过完整的活细胞，但能够对坏死和凋亡晚期的细胞进行染色，因此通常将Annexin V与PI配合染色，以区别凋亡早期细胞与坏死细胞和凋亡的晚期细胞。
【产品组分】
50 T
4x Binding Buffer 10 ml
Propidium Iodide, PI 500 μl
Annexin V-FITC 250 μl
【注意事项】
1．本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。
2．需自备PBS和去离子水。
3．荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
4．PI对人体有刺激性，请注意适当防护。
5．请穿实验服并戴一次性手套操作。
【操作步骤】
1．细胞样品的准备：
a．对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000×g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50 μl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1 ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。再次加入1 ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞。
b．对于悬浮细胞：1000×g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50 μl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1 ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50 μl左右的PBS，以避免吸走细胞。再次加入1 ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞。
2．用去离子水按 1:3 稀释Binding Buffer（4 ml Binding Buffer +12 ml 去离子水）。
3．用 250 μl Binding Buffer重新悬浮细胞，调节其浓度为 1×106/ml。
4．取 100 μl 的细胞悬液于 5 ml 流式管中，加入 5 μl Annexin V/FITC 和 10 μl 20 μg/ml的PI溶液。
5．混匀后于室温避光孵育 15 分钟。
6．在反应管中加 400 μl PBS，流式细胞仪（FACS）分析。
