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AFT Universal Plus RNA Mini Kit 50T AFT2062-01
【储存条件】
室温储存12个月不影响使用效果。本试剂盒所有溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，可在37°C水浴加热几分钟，恢复澄清后再使用。
【产品简介】
本公司独家推出EASYspin无苯酚、氯仿RNA快速提取技术基础上，又独家研发成功基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free water将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
【产品特色】
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
2. 不需要苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀，快速方便，一般可在30分钟内完成。
3. 独家研发成功基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。
4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达2.1-2.2，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。
【产品组份】
50T 注意事项
裂解液RLT plus 50 ml 室温密闭干燥保存
去蛋白液RW1 40 ml 室温密闭干燥保存
漂洗液RW 10 ml 初次使用前请按瓶标说明加入42ml无水乙醇
70%乙醇 9 ml瓶 提供9ml RNase-Free H2O，使用前加入21ml无水乙醇
RNase-Free H2O 10 ml 室温密闭干燥保存
基因组DNA清除套管 50套 室温密闭干燥保存
RNase-Free吸附套管 50套 室温密闭干燥保存
【注意事项】
1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2. 样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大，例如胸腺脾脏DNA含量丰富，超过5mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富，超过3x106细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如细胞不超过3-4x106，组织不超过10mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
3. 裂解液RLTplus 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. 预防RNase 污染，应注意以下几方面：
1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。
2) 使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3) RNA 在裂解液RLT 中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150°C烘烤4 小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4) 配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，37°C放置过夜，高压灭菌。）
5. RNA 纯度及浓度检测：
完整性： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在2.1-2.2 之间（100%纯的RNA比值一般是2.2左右，很多公司无法达到这个标准，所以1.9-2.0就凑合用了，但是我们的产品标准一般可以达到2.1-2.2）。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-Free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260，OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。
【操作步骤】
<实验前请先阅读注意事项，第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!>
1. 组织培养细胞
a. 收集<107悬浮细胞到一个1.5ml离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以直接裂解，细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
b. 13,000rpm离心10秒（或者300g离心5分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
c. 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加入350μl（<5x106细胞）或者600μl（5x106-1x107细胞）裂解液RLT plus，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。
d. 用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。
e. 将裂解混合物或匀浆混合物全部加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。接操作步骤项下3。
2. 动物组织（例如鼠肝脑）
a. 电动匀浆：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块，加入350μl (<20mg组织)或者600μl(20-30mg组织)的裂解液RLT后电动彻底匀浆20-40秒。
b. 液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有350μl/600μl组织裂解液RLTplus的1.5ml离心管中, 用手剧烈振荡20秒，充分裂解。用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。
c. 将匀浆后裂解物13,000rpm离心3分钟，沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物, 将裂解物上清全部加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。
d. 接操作步骤项下3。
3. 立刻13,000 rpm离心60秒，保留滤过液（RNA在滤过液中）。
确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
4. 用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为350μl/600μl，滤过时候损失体积应该减去）,加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
5. 立刻将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心30秒，弃掉废液。
6. 加700μl 去蛋白液RW1，室温放置1分钟，12，000rpm 离心30秒，弃掉废液。
7. 加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。
8. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
9. 取出吸附柱RA，放入一个1.5ml RNase free离心管中（自备，离心时稍微错开斜放盖子，以便能带着盖子离心），根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase-Free H2O（事先在 70-90℃水浴中加热可提高产量）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。
10. 如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase-Free H2O重复步骤9, 合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。
