产品名称 单位 货号
AFT Liquid Sample Total RNA Extraction Reagent (TRIgent LS) 100ml AFT2082-01
【储存条件】
TRIgent LS在室温下能稳定保存12个月。为达到最佳效果，建议保存TRIgent LS在2~8°C的环境下。
【产品简介】
TRIgent LS试剂是直接从来源于人，动植物，酵母，细菌和病毒的液体样品中提取总RNA的试剂。也可以从动物组织、 植物材料、 各种微生物及培养细胞等样品中提取总RNA。
该方法对少量的组织(50-100mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。样品在TRIgent LS中被充分裂解的同时能够最大限度地保证RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液会分成三层：上层无色水相、中间层和下层有机相，RNA 分布在上清层中。收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到总RNA。
提取的总RNA完整性好，无蛋白和DNA污染，可用于各种分子生物学常规实验，如RT-PCR、Real-time RT-PCR、Northern blot、Dot Blot、体外翻译等。
TRIgent LS试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7kb和15 kb之间不连续的高分子量条带(mRNA和hnRNA成分)，两条优势核糖体~5 kb(28S)和~2 kb(18S)，低分子量RNA介于0.1和0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8。
注意如果是普通琼脂糖凝胶电泳，28S的位置大约在2kb，18S大约在1kb的位置，不同浓度的凝胶位置变化较大。
【注意事项】
1. 本品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会导致中毒、灼伤以及其他身体伤害。使用本制品时应穿戴防护物品，如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触，应立即用大量的水冲洗并前往医院治疗。
2. 样品匀浆后，如果不即刻加入氯仿之前，，置于-70°C下可放置一个月以上。保存在75%乙醇中的RNA沉淀，2-8°C可以保存一周，-20°C条件下可以保存1年。RNA半衰期比较短，容易降解，建议提取后尽快进行后续实验，如反转录成cDNA，Northern Blot等。
3. 若下游实验对DNA非常敏感，建议用 RNase free DNase I对RNA进行处理。
4. 自备试剂：氯仿、异丙醇（新开封或提取RNA专用）、75%乙醇(用DEPC处理过的水配制)、 RNase free water或者DEPC处理过的水。
【操作步骤】
<友情提示>：
1) 抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。
2) 在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。
3) 如无特殊说明，所有的操作应该在在15~30°C的室温条件下。
1. 匀浆
a. 生物液体：每0.25ml液体样品(血清，血浆，脑脊液等等)加入0.75ml TRIgent LS，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5~10×106个细胞至少加入0.75ml TRIgent LS。TRIgent LS 和液体样品的终体积比总是3:1。
b. 动物组织：用glass或强力匀浆器搅匀组织样品，每50~100mg组织或者0.25ml组织悬液加0.75ml的TRIgent LS。一般50~100mg组织体积都要小于0.25ml，如果组织样品的体积小于0.25ml，加入灭菌水将组织样品体积调整到0.25ml以保证体积比例是3:1。
c. 单层生长细胞：直接往直径3.5 cm的培养板中加入0.3ml-0.4ml的TRIgent LS裂解细胞，用加样枪吹打帮助充分裂解细胞。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRIgent LS量（每10cm2加0.3-0.4ml）。不需要往裂解物里面加水，因为培养板中附着残留的培养液已经充分稀释了TRIgent LS。
注意：贴壁培养细胞往往不能完全从培养瓶（皿）脱落，这并不意味着裂解不完全，此时细胞膜实际已经完全破裂开，并已释放出RNA，继续做即可。
d. 细胞悬液：通过离心来沉淀细胞。在TRIgent LS试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞。每5~10×106的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1×107细菌加0.75ml的TRIgent LS。和步骤b一样用灭菌水调节样品体积到0.25毫升。在加入TRIgent LS前应避免洗涤细胞，因为那样会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。
e. 植物组织：取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在TRIgent LS中迅速研磨，每50-100mg组织加入0.75ml TRIgent LS，和步骤b一样用灭菌水调节样品体积到0.25毫升，混匀。
2. 将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置5分钟以使核蛋白体完全解离。
3. 可选步骤： 在4°C的条件下以12,000 rpm的离心力离心10分钟，取上清。
如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或肌肉，植物的块茎结节等可离心去除。离心后的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织的样品时，上层是大量油脂应除去。取澄清的匀浆液进行下一步。
4. 每0.75ml TRIgent LS加0.2ml氯仿。盖紧管盖，剧烈震荡15秒并将其在室温下放置2~3分钟。
5. 在4°C 12,000 rpm的离心力高速冷冻离心10-15分钟。离心后混合物分成三层：下层有机苯酚氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIgent LS容量的70%。 （有机层和中间层是蛋白和DNA，如果需要提取，请联系我们索取提取方法）。
6. 将水样层转移到一干净的离心管中，加入等体积异丙醇。 颠倒混匀后室温放置10分钟。
RNA沉淀在离心前通常不可见，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
7. 在室温或者4°C 12,000 rpm 离心10分钟，弃上清。
8. 加入75%乙醇洗涤沉淀。每使用0.75ml TRIgent LS用1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。
9. 在室温或者4°C 12,000 rpm离心3分钟，弃上清，注意不要丢失RNA沉淀。
注意：剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。
10. 室温放置2-3分钟，晾干。加入30-100μl RNase free水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解。
注意：沉淀不要过分干燥，以免难于溶解。
【附注RNA 纯度及浓度检测】
A、完整性： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
B、纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在2.1-2.2 之间（100%纯的RNA比值一般是2.2左右，很多公司无法达到这个标准，所以1.9-2.0就凑合用了，但是我们的产品标准一般可以达到2.1-2.2）。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。
C、浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260，OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。
